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Bio-Rad酶标仪荧光分析技术是一种强大的分析手段,广泛地应用在临床检验、生物学研究、农业科学、食品和环境科学中,是多功能酶标仪的重要应用,如TECAN(M1000、M200等),Thmeral(Varioskan Flash),Bio-tek(Synergy 4等),MD(M2、M5)都可以应用于荧光检测。

Bio-Rad酶标仪概述;

室温下,大多数分子处于基态的*振动能级,处于基态的分子吸收能量(光能、化学能、电能或热能)后跃迁至激发态,激发态不稳定,将很快衰变到基态,以光的形式放出能量,这种现象称为“发光现象”。分子发光包括荧光,磷光,化学发光,生物发光等。受到光照时发光,光照切断时发光立即消失的叫荧光,光照切断时,发光逐渐变弱以致消失的叫磷光,吸收化学反应的化学能量而发光叫化学发光,由生物能转变为光辐射的称作生物发光。

由于发光物质不同荧光有分子荧光和原子荧光之分,分子荧光为带光谱,原子荧光为线光谱,通常所说的荧光为分子荧光。通过测定所发射荧光的特性和强度,可以对物质进行定性、定量分析。

Bio-Rad酶标仪荧光检测技术;

1荧光强度

荧光强度与荧光物质的浓度成正比,这是荧光分析法是量分析的依据。在生物学上的应用非常广泛,可以进行生物大分子定量,酶活性分析,荧光免疫分析,细胞学分析(细胞增殖,细胞毒理,细胞吸附等)和分子间相互作用。

1.1细胞凋亡检测

Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用,其中Caspase-3为关键的执行分子,它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原(32KD)的形式存在于胞浆中,在凋亡的早期阶段,它被激活,活化的Caspase-3由两个大亚基(17KD)和两个小 亚基(12KD)组成,裂解相应的胞浆胞核底物,*终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞,caspase-3的活性明显下降。

设计出荧光物质偶联的短肽Z-DEVD-AMC。在共价偶联时,AMC不能被激发荧光,短肽被水解后释放出AMC,自由的AMC才能被激发发射荧光。根据释放的AMC荧光强度的大小,可以测定 caspase-3的活性,从而反映Caspase-3被活化的程度。

1.2细胞毒性的检测

体外细胞毒性研究对于检测新的生物来源或人工合成的细胞毒素以及例行的临床相关的检测都有着重要的意义。细胞膜非渗透性的核染料 Propidium iodide能穿透损伤的细胞膜,荧光密度越高反映出其受损细胞越多。

1.3钙流检测

Fura-2、indo-1、Quin-2是Ca2+荧光指示剂,可以灵敏地反映细胞内钙离子浓度的变化,当结合钙离子时,*激发波长会发生改变,发射荧光的强度和结合的Ca2+浓度有着定量的关系。

2.荧光偏振(FP)

1926年Perrin首先描述了荧光偏振理论,溶液中的荧光分子在受到偏振光照射时,可吸收并释放出相应的偏振荧光,如果在激发时荧光物质处于静止状态,发射光将保持原有激发光的偏振性,如果其处于运动状态,发射光电偏振偏振平面将不同于原有激发光的偏振特性,这就是荧光偏振现象,荧光分子与其它因子的相互作用,例如相互结合或排斥;其所处环境的性质,例如溶液的粘度、温度等,这些因素都有可能对这个荧光因子受激发后发出的发射光的发射平面产生影响。因此以荧光偏振为基础发展的技术可用来研究生命科学中分子之间的相互作用,如受体配体结合分析,DNA-蛋白质结合分析,SNP分析,酶活性分析。荧光偏振分析所需的样品量少,灵敏度高,可达亚纳摩尔级范围,重复性好,操作简便,也更为安全可靠,不会在实验过程中生成有害的放射性废物,此外荧光偏振是真正均相的,允许实时检测(动力学检测),对于浓度变化不敏感,是均相检测形式(中间不含洗涤步骤)的解决方案。